การย้อมสีแกรม

ผู้ที่คิดค้นการย้อมสีวิธีนี้คือ Hans Christian Gram ในปี คศ. 1884 ผลของการย้อมสีแกรมทำให้จำแนกแบคทีเรียออกได้ 2 กลุ่ม คือ

1. แกรมบวก (Gram Positive) แบคทีเรียที่ย้อมติดสีน้ำเงินม่วง

2. แกรมลบ (Gram Negative) แบคทีเรียที่ย้อมติดสีแดง

สีและสารละลายที่ใช้ทั้งหมด

1. Crystal violet

2. สารละลายไอโอดีน

3. เอทธิลแอลกอฮอล์ 95%

4. Safranin

5. น้ำกลั่น

วิธีการย้อมแกรม

1. smear เชื้อที่ต้องการย้อมลงบนสไลด์ที่สะอาด ทิ้งให้แห้ง จากนั้นตรึงตัวเซลล์ด้วยการผ่านเปลวไฟ (ระวังเซลล์จะแตกตายก่อนด้วย) การตรึงเซลล์จะช่วยให้เซลล์แห้งติดกับแผ่นกระจกสไลด์

2. หยด Ammonium oxalate crystal violet บนเชื้อที่ smear นานประมาณ 1 – 2 นาที แล้วเทสีทิ้ง

3. หยดสารละลายไอโอดีนตามลงไปนานประมาณ 2 นาที แล้วเททิ้ง สารละลายไอโอดีนจะช่วยให้เซลล์ย้อมติดสีได้ดีขึ้น

4. ขั้นตอนนี้เรียกว่า Decolorized โดยการล้างสีด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ 95% นาน 30 วินาที แล้วจึงตามด้วยน้ำกลั่น

5. หยดสีSafraninบนเชื้อนานประมาณ 15-30 วินาที ล้างสีด้วยน้ำ แล้วจึงมองเซลล์ผ่านทางกล้องจุลทรรศน์

ลักษณะการเปลี่ยนแปลงระหว่างการย้อมแกรมของแบคทีเรีย

*** เวลาย้อมแกรมระวังสีหยดลงบนโต๊ะที่ทำการทดลอง เพราะขัดล้างไม่ค่อยออก ***

หลักเกณฑ์ในการย้อมแกรม

1. เซลล์ปกติ ( vegetative cell )เท่านั้นที่ติดสีแกรมบวกหรือแกรมลบ แต่ถ้าเซลล์เกิดแตกขึ้นมาจะติดสีเฉพาะแกรมลบเท่านั้น

2. การย้อมแกรมต้องใช้ crystal violet และสารละลายไอโอดีนเสมอ

3. แบคทีเรียเท่านั้นที่ให้ผลต่างกันในการย้อมแกรม แต่จุลินทรีย์ชนิดอื่นๆ จะติดสีย้อมแกรมอย่างใดอย่างหนึ่งเท่านั้น เช่น เซลล์ยีสต์จะติดสีแกรมบวก

4. การย้อมสีแกรมสามารถเปลี่ยนแบคทีเรียแกรมบวกเป็นแกรมลบได้ แต่สามารถเปลี่ยนแบคทีเรียแกรมลบไปเป็นแกรมบวกได้

5. ไซโตพลาสซึมติดสีแกรมลบเท่านั้น

6. แบคทีเรียแกรมบวกถูกล้างสียากกว่าแกรมลบ

7. สปอร์ที่ยังไม่เจริญเต็มที่ ( immature endospore) จะติดสีแกรมบวก ส่วนสปอร์ที่เจริญเต็มที่ ( mature endospore) ไม่ติดสีแกรม

การเตรียมสีในการย้อมแกรม

1. Ammonium oxalate crystal violet

เราจะต้องเตรียมสารละลาย Gram’s crystal violet และAmmonium oxalate ผสมเข้าด้วยกัน โดยวิธีการเตรียมทำตามขั้นตอนต่อไปนี้

1.1 เตรียม Gram’s crystal violet

– Crystal violet 2.0 กรัม

– เอทธิลแอลกอฮอล์ 20.0 มิลลิลิตร

ให้ทำการละลาย Crystal violet ในเอทธิลแอลกอฮอล์

1.2 เตรียม Ammonium oxalate

– Ammonium oxalate , C.P 0.8 กรัม

– น้ำกลั่น 80.0 มิลลิลิตร

ละลาย Ammonium oxalate ในน้ำกลั่น

เมื่อได้ทั้ง Gram’s crystal violet และ Ammonium oxalate แล้ว จากนั้นให้ผสมสารละลายทั้งสองเข้าด้วยกันและคนให้เข้ากัน

2. สารละลายไอโอดีน

– Iodine , C.P 1.0 กรัม

– Potassium Iodide, C.P ( KI ) 2.0 กรัม

– น้ำกลั่น 300.0 มิลลิลิตร

ผสม Iodine และ Potassium Iodide ในโกร่ง ใช้สากบดให้ละเอียด แล้วจึงค่อยๆเติมน้ำกลั่นลงไป ผสมให้เป็นเนื้อเดียวกับน้ำน้ำกลั่น

3. Safranin

– Safranin 0.25 กรัม

– เอทิลแอลกอฮอล์ 10.00 มิลลิลิตร

– น้ำกลั่น 100.00 มิลลิลิตร

ละลาย Safranin ในเอทธิลแอลกอฮอล์ แล้วจึงเติมน้ำกลั่น และทำการคนให้เข้ากัน จากนั้นจีงกรองผ่านกระดาษกรองเอาแต่ส่วนที่เป็นของเหลวสีแดงไปใช้

สุดท้ายก่อนจบ มาดูวิดิโอการย้อมแกรมประกอบเพื่อทำความเข้าใจ และเห็นภาพในการปฏิบัติงานจริง